首乌研究
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白首乌粗多糖对酒精性肝损伤的保护作用研究

作者:杨小红,袁江,周远明,张瑜,曾亚翎,刘谋治,赵冰清

【摘要】目的探讨白首乌(耳叶牛皮消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)多糖对小鼠肝损伤的保护作用。方法从白首乌(耳叶牛皮消)中提取粗多糖,将 84只健康小鼠动物随机分组,随机分为模型组、生理盐水对照组、阳性对照组和 3个实验对照组。实验组每组14只按低剂量组(100 mg·kg-1·d-1)、中剂量组(250 mg·kg-1·d-1)、高剂量组(500 mg·kg-1·d-1)连续灌胃多糖 8 d,对照组按等量生理盐水灌胃。通过摘眼球取血测量谷丙转氨酶( AST)、谷草转氨酶( ALT)含量。结果白首乌多糖肝损伤防治组小鼠血清 ALT及 AST活性比模型组显著降低,两组比较,差异有统计学意义。结论白首乌多糖对酒精所致小鼠急性肝损伤模型具有显著的保护作用。

【关键词】耳叶牛皮消;粗多糖;酒精;肝损伤

Key words:Cynanchum auriculatum Royle ex Wight; Polysaccharide; Alcohol; Liver injury

白首乌为祖国传统中药,其主要来源为萝藦科植物耳叶牛皮消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight,隔山消 Cynanchum wilfordii (Maxim.)Hemsl和戟叶牛皮消 Cynanchum bungei Decne.的块根,具有养血益肝、固肾益精、乌须黑发和延年益寿的功效[ 1,2]。现代研究发现白首乌中含有多种有效成分,具有抗肿瘤、抗衰老和保肝等多方面的药理活性[ 1,3]。国外的研究也证实了这些药理活性[ 4~6]。

1器材

1.1药品与试剂
白首乌购自江苏滨海,经湖南省药检所方石林教授鉴定为萝摩科植物耳叶牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight,实验用酒精( AR),谷草转氨酶 (ALT)试剂盒(南京建成生物工程研究所 )。谷丙转氨酶酶 (AST)试剂盒 (南京建成生物工程研究所 )。氯仿、丙酮、乙醚、正丁醇均为分析纯。护肝片为北京亚东生物制药有限公司生产。

1.2仪器与设备
电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司) 202-3AB型;电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司) DK-98-1A;真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) RE 52-99;抽滤机(郑州长城科工贸有限公司) SHB-B95型;离心沉淀机(上海医用分析仪器厂) LXT-II;分析天平(湘仪天平仪器厂) TG328B。

1.3实验动物 ICR小鼠 (长沙市开福区实验动物科技服务部提供 ,动物合格证号:湘 000468)。
1.4实验数据处理软件
实验数据均在 LENOVO-compatible PC机 Windows XP系统下采用 Excel2003进行计算和统计学处理,并用 T-test来分析组间差异的显著性。结果以 ±s表示。文字处理软件用 Microsoft Word2003。

2方法

2.1多糖的提取分离
2.1.1预处理脱脂
取 60 g白首乌 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight粉末,加 180 ml乙醇(85%),加热回流 1 h,过滤,滤渣于恒温箱中 80℃干燥过夜[ 2],得淡黄色滤渣 52.5 g。

2.1.2初多糖的提取浸提
将黄色滤渣 52.5 g均分于两个 1 000 ml圆底烧瓶中 ,A瓶为 26.2 g,B瓶为 26.3 g。A、B瓶各加 520 ml水,在恒温水浴中回流 1 h,过滤,滤渣在相同条件下重复浸提 1次,合并滤液。

离心:将两次浸液离心机离心 10 min(2 500 r/min),合并滤液。

减压浓缩:将合并滤液在真空旋转蒸发器中浓缩至 75 ml。

真空干燥:在浓缩后的多糖溶液中加入 3倍量 95%乙醇( AR)225 ml,抽滤,真空干燥后得淡黄色粗多糖。

2.2粗多糖的纯化
2.2.1脱蛋白
粗多糖加蒸馏水 200 ml复溶后经过 Sevag试剂 (氯仿 20 ml,正丁醇 4 ml)除蛋白,连续操作 4次,得 150 ml多糖溶液。

2.2.2醇沉
在脱蛋白后的多糖溶液中加入 3倍 95%乙醇,沉淀用乙醇洗涤 3次,经抽滤、真空干燥后得到浅灰色粉末状结晶。

2.2.3纯化
将灰白色结晶用乙醇、丙酮及乙醚反复洗涤,抽滤、真空干燥后得到浅灰色粉末状结晶。
2.3多糖的验证
2.3.1多糖检测反应
取多糖粉末少许用蒸馏水溶解,取 1 ml于试管中,再加 10% α-萘酚的乙醇溶液 3滴,均匀混合,沿管壁加浓硫酸 1 ml,使集于下层,在两层交界面有棕色环出现,证明此为多糖。

2.3.2水解
取上述粉末 20 mg置锥形瓶内,加入 2 mol/L的硫酸甲醇溶液 2 ml,封口,置 85℃水浴中水解 24 h,冷却,用饱和 Ba(OH)2中和,离心,取上清液,减压浓缩至干,待用。

2.3.3单糖组分的纸色谱层析
用微量点样器分别取样品水解液和标准葡萄糖液各 4~5 μl,在纸色谱上点样,置于展开筒中展开,展开系统为 :正丁醇 ∶醋酸 ∶水 (4∶1∶5)上层, 自然风干后用邻苯二甲酸苯胺显色,样品水解液出现 4个棕色点,如图 1,其中有一个点与标准葡萄糖溶液的点 Rf值一样,说明样品中确含多糖。

2.4药理实验
2.4.1动物分组
取 84只 ICR健康小鼠(雌雄各半),随机分为 6组,分别为正常对照组、模型组、阳性对照组,多糖低、中、高剂量给药组 (500,250,100 mg/kg)。

2.4.2给药
实验室适应性饲养 7 d后,浏阳河酒灌胃 0.5 ml/只。多糖高、中、低剂量给药组分别按500,250,100 mg/kg 灌胃提取的精制耳叶牛皮消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight多糖溶液;阳性对照组按 80 mg/kg灌胃护肝片溶液;正常对照组和模型对照组等体积生理盐水灌胃, 1次/d,2.0 ml/只,连续 8 d。第 8天摘眼球取血分离血清[ 6]。

2.4.3取血
采用摘眼球取血方法,每只试验用小鼠各取血 1 ml于肝素润洗过的 1.5 ml中。
2.4.4分离血清
将离心管置高速离心机中 3 000 r/min离心 10 min,用微量注射器提取血清置肝素润洗过的 0.5 ml离心管中,置 -30℃冷冻保存备用。

2.4.5生化检测
按试剂盒说明测定谷草转氨酶( ALT),谷丙转氨酶( AST)活性[ 7]。
2.4.6统计学处理
数据以 ±s表示,用 T检验来分析组间差异的显著性。 P<0.05认为有统计学意义。
3结果

耳叶牛皮消多糖溶液对酒精引起小鼠急性肝损伤血清 ALT,AST活性的影响。结果见表 1。
表 1耳叶牛皮消多糖对酒精诱导的急性肝损伤小鼠血清中 ALT,AST的影响(略)

4讨论

多糖中、高剂量均可使小鼠酒精肝损伤血清 ALT,AST升高的水平降低。模型对照组 ALT,AST活性较正常对照组明显升高 (P<0.01),说明酒精致小鼠肝损伤造模成功。多糖低剂量组与模型组对照比较,P>0.05,不能说明有显著差异 ,说明低剂量组对酒精性肝损伤有一定的保护作用,但作用效果不明显。多糖中剂量组,高剂量组与模型组比较, P<0.01,有显著差异,说明多糖中浓度 (250 mg/ml),高浓度(500 mg/ml)均对酒精性肝损伤有很好的保护作用。高剂量组与阳性对照组比较, P <0.05,有差异,说明多糖高浓度 (500 mg/ml)具有与护肝片相同的对酒精性肝损伤有很好的保护作用,甚至效果更好。

实验结果显示,模型对照组 ALT,AST活性显著高于正常对照组,表明酒精诱导的急性肝损伤模型成功 (P<0.01)。多糖中剂量组,高剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05),说明此剂量下的耳叶牛皮消多糖溶液能显著降低由酒精引起急性肝损伤小鼠血清 ALT和 AST活性的升高,且存在剂量效应关系。多糖高剂量组与阳性对照组比较,效果差异不大,甚至可以说更好,具有很大的潜力,值得深入研究,必能成为更好的保肝护肝药。虽然多糖高剂量组与中剂量组降低 AST活性的效果相当,但他们降低 ALT活性的效果却有一定差距 ,多糖低剂量组对 AST和 ALT活性的降低有一定效果 ,但都不明显。从这里可以看出,耳叶牛皮消多糖溶液的浓度与降低 AST和 ALT活性的效果之间有一定的联系,什么浓度效果最佳,其确切保肝作用机制还需要进一步研究。本次实验从 ALT,AST活性的角度入手,研究白首乌多糖溶液的保肝护肝作用,经实验证明耳叶牛皮消多糖溶液具有保肝护肝的作用。

【参考文献】

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